تکنیک‌های افزایش دقت در تست ایمونواسی؛ از کنترل نمونه تا کالیبراسیون دستگاه

تست‌های Immunoassay از مهم‌ترین روش‌های آزمایشگاهی برای اندازه‌گیری هورمون‌ها، مارکرهای قلبی، تومورمارکرها، پروتئین‌ها، آنتی‌بادی‌ها و بسیاری از آنالیت‌های دیگر هستند. با وجود پیشرفت قابل توجه دستگاه‌های اتوماتیک ایمونواسی، کیفیت نتیجه همچنان به مجموعه‌ای از عوامل پیش‌تحلیلی، تحلیلی و پس‌تحلیلی وابسته است.

در عمل، داشتن یک دستگاه پیشرفته به‌تنهایی تضمین‌کننده نتیجه دقیق نیست. کیفیت نمونه، وضعیت معرف‌ها، کالیبراسیون، کنترل کیفی، نحوه Pipetting، شرایط Incubation، شست‌وشوی صحیح، تداخلات نمونه و حتی Maintenance دستگاه می‌توانند نتیجه نهایی را تحت تأثیر قرار دهند.

بنابراین افزایش دقت در تست ایمونواسی بیشتر از آنکه به یک تکنیک خاص وابسته باشد، نتیجه کنترل سیستماتیک کل Workflow آزمایش است.

دقت در تست ایمونواسی دقیقاً به چه معناست؟

در محیط آزمایشگاه معمولاً چند مفهوم در کنار یکدیگر مطرح می‌شوند: Accuracy، Precision، Repeatability و Reproducibility.

Accuracy به میزان نزدیکی نتیجه آزمایش به مقدار واقعی یا مقدار مرجع اشاره دارد، در حالی که Precision نشان می‌دهد نتایج تکراری یک نمونه تا چه اندازه به یکدیگر نزدیک هستند.

ممکن است یک سیستم Precision خوبی داشته باشد اما به دلیل Calibration نادرست، نتایج آن به‌صورت سیستماتیک از مقدار واقعی فاصله داشته باشند. بنابراین برای ارزیابی کیفیت یک Immunoassay باید هم تکرارپذیری و هم صحت نتیجه در نظر گرفته شود.

1. کنترل کیفیت نمونه پیش از انجام آزمایش

بخش قابل توجهی از خطاهای آزمایشگاهی پیش از ورود نمونه به مرحله اندازه‌گیری اتفاق می‌افتد. نوع لوله، نحوه نمونه‌گیری، حجم نمونه، زمان انتقال، شرایط نگهداری و وضعیت فیزیکی نمونه همگی می‌توانند بر نتیجه اثر بگذارند.

در سیستم‌های جدید ایمونواسی، بخشی از این کنترل‌ها به‌صورت خودکار انجام می‌شود. برای مثال، در سیستم ADVIA Centaur CP قابلیت‌هایی مانند Pressure-based Level Sensing، تشخیص نمونه ناکافی، Clot Detection و تشخیص نمونه Foam دار برای کنترل وضعیت نمونه پیش از یا هنگام پردازش در نظر گرفته شده‌اند.

وجود چنین قابلیت‌هایی احتمال ادامه یافتن فرآیند روی یک نمونه نامناسب را کاهش می‌دهد، اما کنترل اولیه اپراتور همچنان اهمیت دارد.

همولیز، لیپمی، ایکتر و وجود لخته از جمله مواردی هستند که بسته به نوع Assay ممکن است باعث تداخل شوند. به همین دلیل باید همواره دستورالعمل اختصاصی همان تست و محدودیت‌های Sample Type بررسی شود.

2. رعایت حجم صحیح نمونه

حجم ناکافی نمونه می‌تواند یکی از دلایل مهم خطا در اندازه‌گیری باشد.

بعضی Immunoassayها تنها به حجم بسیار کمی از Serum یا Plasma نیاز دارند، اما همین حجم باید به‌صورت دقیق برداشت شود. برای مثال در Spec Sheet سیستم ADVIA Centaur CP حجم نمونه بسته به Assay بین حدود 10 تا 300 میکرولیتر ذکر شده است.

اگر سیستم قادر به تشخیص Short Sample باشد، بخشی از ریسک کاهش می‌یابد؛ با این حال استفاده از حجم صحیح نمونه و لوله مناسب همچنان ضروری است.

3. Pipetting دقیق و کاهش Carryover

در بسیاری از Immunoassayها حجم نمونه و معرف بسیار کم است. بنابراین خطای کوچک Pipetting می‌تواند نسبت اجزای واکنش را تغییر دهد.

سیستم‌های اتوماتیک جدید از راهکارهای مختلفی برای افزایش دقت Pipetting استفاده می‌کنند.

برای مثال در SKYLAB 752 دو بازوی Dispensing مستقل به Flow Meter Sensor مجهز شده‌اند و علاوه بر آن قابلیت تشخیص Clot و Bubble نیز دارند. بروشور سازنده همچنین اشاره می‌کند که استفاده از Disposable Tip برای کاهش Carryover طراحی شده است.

در ADVIA Centaur CP نیز از Disposable Pipette Tips برای جلوگیری از Sample Carryover استفاده می‌شود.

Carryover زمانی اتفاق می‌افتد که مقدار کمی از یک نمونه یا معرف وارد آزمایش بعدی شود. این مسئله به‌ویژه در نمونه‌هایی با غلظت بسیار بالا می‌تواند نتیجه نمونه بعدی را تحت تأثیر قرار دهد.

4. کالیبراسیون صحیح دستگاه

Calibration یکی از پایه‌های اصلی صحت Immunoassay است.

در کالیبراسیون، پاسخ دستگاه در برابر مقادیر مشخصی از آنالیت تنظیم می‌شود تا Signal تولیدشده به نتیجه کمی قابل اعتماد تبدیل شود.

اشتباه در Lot معرف، استفاده از Calibrator نامناسب، Calibration منقضی‌شده یا تغییر شرایط سیستم می‌تواند باعث ایجاد Bias شود.

در سیستم ADVIA Centaur CP اطلاعات Calibration از طریق Barcode حاوی اطلاعات اختصاصی Lot قابل شناسایی است و سیستم وضعیت Calibration و نزدیک شدن به زمان انقضا را نیز پیگیری می‌کند.

برای افزایش اطمینان از نتایج، بهتر است Calibration صرفاً به‌عنوان یک مرحله ابتدایی در نظر گرفته نشود؛ وضعیت آن باید در طول دوره استفاده از Reagent نیز پایش شود.

5. اجرای منظم Quality Control

Calibration به‌تنهایی کافی نیست.

پس از کالیبراسیون باید با استفاده از مواد کنترل، عملکرد سیستم در طول زمان پایش شود. هدف QC این است که تغییرات تدریجی، Shift، Trend یا خطاهای تصادفی قبل از اینکه تعداد زیادی از نتایج بیماران تحت تأثیر قرار بگیرند شناسایی شوند.

در سیستم‌های پیشرفته‌تر، ابزارهای نرم‌افزاری QC نیز در اختیار اپراتور قرار می‌گیرند. برای مثال ADVIA Centaur CP از Levey-Jennings Plot و Westgard Rules برای پایش طولانی‌مدت QC پشتیبانی می‌کند.

استفاده درست از Westgard Rules می‌تواند به شناسایی خطاهای سیستماتیک و تصادفی کمک کند؛ البته قوانین QC باید متناسب با Assay، عملکرد سیستم و سیاست کنترل کیفیت آزمایشگاه انتخاب شوند.

6. کنترل شرایط Incubation

بسیاری از واکنش‌های Immunoassay به زمان و دمای مشخص وابسته هستند.

اگر Incubation کوتاه‌تر یا طولانی‌تر از حد تعیین‌شده باشد یا دما به‌درستی کنترل نشود، میزان اتصال Antigen و Antibody ممکن است تغییر کند و روی Signal نهایی اثر بگذارد.

در خانواده ACCRE، بروشور فرآیند Assay را به چهار مرحله اصلی Incubation، Separation، Reaction و Reading تقسیم می‌کند و برای مرحله Incubation کنترل دمای دقیق 37°C را ذکر می‌کند.

در سیستم‌های ELISA/IFA اتوماتیک مانند SKYLAB 752 نیز Incubatorهای اختصاصی و چند موقعیت Incubation برای کنترل بهتر فرآیند وجود دارد.

بنابراین پایداری Temperature Control یکی از عوامل مهم برای افزایش تکرارپذیری نتایج است.

7. بهبود فرآیند شست‌وشو

در بسیاری از Immunoassayها، شست‌وشوی ناکافی باعث باقی ماندن مواد غیرمتصل می‌شود و ممکن است Background Signal را افزایش دهد.

از طرف دیگر، شست‌وشوی بیش از حد یا نامناسب هم می‌تواند روی واکنش اثر بگذارد.

در سیستم SKYLAB 752، Washing Station به‌صورت اتوماتیک کار می‌کند و برای Aspiration روی چند نقطه کالیبره شده است. دستگاه همچنین امکان استفاده از چند Washing Buffer و کنترل فشار شست‌وشو را دارد.

در سیستم‌های Manual ELISA، کنترل Volume بافر، تعداد Wash Cycle، زمان قرار گرفتن بافر و حذف کامل مایع باقی‌مانده اهمیت ویژه‌ای دارد.

8. کاهش Background Signal

هرچه Signal اختصاصی تست نسبت به Background بالاتر باشد، تفکیک غلظت‌های پایین آنالیت ساده‌تر خواهد بود.

بعضی فناوری‌های ایمونواسی برای کاهش Background طراحی شده‌اند. برای مثال، سیستم Exdia TRF Plus از فناوری Time-Resolved Fluorescence استفاده می‌کند.

در این روش، Fluorescence در بازه زمانی مشخصی پس از تحریک اندازه‌گیری می‌شود و طبق توضیحات سازنده، این فناوری می‌تواند Auto-fluorescence و Interference Signal را کاهش داده و نسبت Signal-to-Noise را بهبود دهد.

در نتیجه، انتخاب تکنولوژی Detection متناسب با نیاز آزمایشگاه نیز می‌تواند بر Sensitivity و کیفیت نتایج تأثیر داشته باشد.

9. جداسازی مؤثر در Immunoassay

در بعضی سیستم‌ها مرحله Separation نقش بسیار مهمی در حذف اجزای ناخواسته دارد.

برای نمونه، سیستم‌های ACCRE از Nano Magnetic Particles برای جداسازی استفاده می‌کنند. پس از Incubation، ذرات مغناطیسی به جداسازی Complex مورد نظر کمک کرده و سپس واکنش Chemiluminescence انجام می‌شود.

هرچه Separation کامل‌تر باشد، احتمال باقی ماندن مولکول‌های غیرمتصل و افزایش Background کمتر می‌شود.

10. توجه به وضعیت معرف‌ها

حتی بهترین دستگاه هم با Reagent نامناسب نتیجه قابل اعتماد تولید نمی‌کند.

دمای نگهداری، Shelf Life، On-board Stability، دفعات خارج شدن از یخچال و نحوه مخلوط شدن Reagent همگی اهمیت دارند.

سیستم‌های اتوماتیک مدرن بسیاری از این موارد را پایش می‌کنند. ADVIA Centaur CP برای مثال موجودی Reagent، Calibration Validity، On-board Residency و وضعیت Expired یا Low Reagent را به‌صورت خودکار کنترل می‌کند.

بنابراین هنگام بررسی یک نتیجه غیرمنتظره، وضعیت Reagent یکی از اولین مواردی است که باید بررسی شود.

11. کاهش دخالت دستی اپراتور

هر مرحله دستی می‌تواند منبعی برای Variability باشد.

Pipetting دستی، زمان‌بندی Incubation، شست‌وشوی Microplate، Dilution نمونه و ثبت دستی اطلاعات همگی احتمال خطای انسانی را افزایش می‌دهند.

اتوماسیون مناسب می‌تواند بخشی از این Variability را کاهش دهد، به‌خصوص زمانی که سیستم امکان Auto-dilution، Auto-repeat و Auto-reflex داشته باشد.

ADVIA Centaur CP هر سه قابلیت را برای Workflow تست ارائه می‌کند.

هدف اتوماسیون حذف کامل نقش اپراتور نیست؛ بلکه استانداردسازی مراحل تکرارشونده است.

12. توجه به تداخلات Immunoassay

یکی از موضوعات مهم در Immunoassay، وجود Interference است.

عواملی مانند Heterophile Antibody، Human Anti-Animal Antibody، Biotin در بعضی سیستم‌ها، Autoantibody، Hook Effect و Cross-reactivity ممکن است بسته به طراحی Assay باعث نتیجه غیرمنتظره شوند.

در چنین شرایطی نتیجه باید در کنار وضعیت بالینی بیمار، سابقه درمان، سایر آزمایش‌ها و دستورالعمل اختصاصی Assay تفسیر شود.

اگر نتیجه با وضعیت بیمار همخوانی ندارد، اقداماتی مانند تکرار تست، Dilution، استفاده از روش دیگر یا بررسی با پلتفرم متفاوت ممکن است توسط آزمایشگاه در نظر گرفته شود.

13. Maintenance منظم دستگاه

آلودگی Probe، رسوب در مسیرها، خرابی سیستم Dispensing، تغییر عملکرد سیستم اپتیکی یا مشکلات Temperature Control می‌توانند به‌تدریج روی نتیجه اثر بگذارند.

بنابراین Preventive Maintenance باید طبق برنامه سازنده انجام شود.

در Spec Sheet دستگاه ADVIA Centaur CP، Maintenance روزانه اتوماتیک و زمان Hands-on کمتر از 5 دقیقه برای بخش روزانه ذکر شده است. برنامه هفتگی و ماهانه نیز به‌طور جداگانه تعریف شده است.

Maintenance را نباید فقط زمانی انجام داد که دستگاه Error بدهد؛ نگهداری پیشگیرانه بخشی از سیستم کنترل کیفیت است.

مهم‌ترین عوامل مؤثر بر دقت Immunoassay

آیا دستگاه پیشرفته‌تر همیشه نتیجه دقیق‌تری می‌دهد؟

نه لزوماً.

تکنولوژی دستگاه نقش مهمی دارد، اما Accuracy نهایی به مجموعه دستگاه، Reagent، Calibration، QC، نمونه و اپراتور وابسته است.

یک سیستم پیشرفته که QC آن به‌درستی مدیریت نمی‌شود ممکن است عملکرد ضعیف‌تری نسبت به یک سیستم ساده‌تر ولی تحت کنترل کیفی مناسب داشته باشد.

به همین دلیل هنگام انتخاب دستگاه ایمونواسی، علاوه بر Throughput و تعداد تست‌ها باید مواردی مانند Sample Integrity Control، سیستم Calibration، مدیریت QC، Detection Technology، قابلیت Traceability، Automation و Maintenance نیز بررسی شوند.

جمع‌بندی

افزایش دقت در تست ایمونواسی نتیجه کنترل یک مرحله خاص نیست، بلکه حاصل مدیریت کل فرآیند آزمایش است.

شروع با نمونه مناسب، Pipetting صحیح، کنترل Carryover، Calibration معتبر، QC منظم، کنترل Incubation و Washing، استفاده صحیح از Reagent و Maintenance منظم همگی در کیفیت نتیجه نقش دارند.

در دستگاه‌های جدید ایمونواسی بسیاری از این فرآیندها به‌صورت اتوماتیک انجام می‌شوند. قابلیت‌هایی مانند Sample Integrity Control، Disposable Tip، Barcode Identification، Auto-dilution، Auto-repeat، QC Software و Automated Maintenance می‌توانند Variability را کاهش دهند، اما همچنان رعایت دستورالعمل سازنده و سیاست کنترل کیفیت آزمایشگاه ضروری است.